magyar elektronika

Hírlevél

Tájékozódjon legfrissebb cikkeinkről, híreinkről!

Valós email cím megadása kötelező

Invalid Input

Invalid Input

Digi lidAz áramlásos citometriát a klinikusok és a diagnoszták széles körben használják a sejtek jellemzőinek elemzésére. Az áramlásos citometria sejtenként, optikai úton értékeli ki többek között a fehérjeszintet, a vér egészségét, a szemcsézettséget és a sejtek méretét. Bár ezek rendkívül érzékeny rendszerek, a citométerek tervezői folyamatos nyomás alatt állnak, hogy növeljék az elemzés sebességét, rövidítve ezzel az elemzési időt, ami új megközelítési módokat igényel mind az áramlásos citometria, mind a hozzá kapcsolódó elektronika terén.

 

A citométerek lézerfénnyel sugározzák be az egyes sejteket, hogy szórt és fluoreszcens jeleket hozzanak létre. Az így keletkező fény gyors és pontos rögzítéséhez, továbbá digitális jelekké alakításához lavina-fotodiódára (APD) és összetett elektronikára van szükség. Az ehhez a folyamathoz szükséges áramkörök megtervezése és megvalósítása hosszú időt vehet igénybe, különös tekintettel arra, hogy az áramlásos citometriás adatgyűjtő rendszerek a rendszer pontosságának biztosítása érdekében nagy sebességű, alacsony zajszintű eszközöket igényelnek.
A tervezők a sebesség és a pontosság jelentette problémák megoldására belső erősítővezérlőkből és egy analóg-digitális átalakítóból (ADC) álló adatgyűjtő eszközt használva állíthatnak elő költségtakarékosan gyorsabb áramlásos citometriás elemzésre alkalmas eszközöket.
Ez a cikk röviden leírja az áramlásos citometriás rendszerek működését. Ezután ismerteti az Analog Devices cég ADAQ23878 jelű analóg-digitális átalakítómodulját, valamint azt, hogyan használható fel áramlásos citométerek érzékelő- és átalakítófokozatának kialakításához. A végén a cikk bemutat egy ehhez az eszközhöz készült fejlesztőkészletet is.

 

A korszerű áramlásos citometria alapelvei

A korszerű áramlásos citometria olyan automatizált folyamat, amely elemzi a sejt- és a felszíni molekulákat, valamint jellemzi és meghatározza egy heterogén sejtpopulációban a különböző sejttípusokat. Az előkészítési időt nem számítva, amely több mint egy óra is lehet, a műszer kevesebb mint egy perc alatt értékeli 10 000 különálló sejt három-hat jellemzőjét.
Ennek a lehetővé tételéhez kritikus fontosságú az áramlásos citometria egysejtes sorba rendezését megvalósító előkészítő lépés. A minták kialakítása egy köpenyfolyadékban, hidrodinamikusan történik, hogy a sejteket vagy részecskéket egy keskeny, egysejtes sort alkotó mintaáramba rendezzék (fókuszálják) az elemzéshez. Ezen átalakítás során az egyes sejteknek meg kell őrizniük természetes biológiai jellemzőiket és biokémiai összetevőiket.
Az 1. ábrán egy áramlásos citométer elvi rajza látható, amely a fenti részen a többsejtes mintával kezdődik.

 

Figure 1

1. ábra Áramlásos citométer működési vázlata a köpeny­folyadékban történő fókuszálástól az adatgyűjtésig (kép: Wikipedia, módosította: Bonnie Baker)

 


Az áramlásos citométer hat fő összetevője: egy áramlási cella, egy lézer, egy lavina-fotodióda (APD), egy transzimpedanciás erősítő (TIA), egy analóg-digitális átalakító (ADC) és egy számítógép az adatgyűjtéshez és elemzéshez.
Az áramlásos citométerben a sejteket szállító valamilyen áramló folyadék vagy más néven köpenyfolyadék található, amelynek útja szűkül, hogy a sejteket egy sorba rendezze a fénysugáron való áthaladáshoz. A lézerfény egyszerre egy sejtet világít meg, és egy előre szórt fényből (FSC, forward-scattered light) és egy oldalra szórt fényből (SSC, side-scattered light) álló jelet hoz létre. A fluoreszcens fényt tükrök és szűrők segítségével válogatják szét, majd egy lavina-fotodiódával erősítik fel.
A következő lépés a lavina-fotodiódát érő kibocsátott fény érzékelése, digitalizálása és elemzése. Az Analog Devices LTC6268 jelű, 500 MHz-es, rendkívül kis előfeszítési áramú, kis feszültségzajú, FET-es bemenetű műveleti erősítője ideális az érzékeléshez szükséges nagy sebességű transzimpedanciás erősítő kialakításához.

 

Figure 2

2. ábra A transzimpedanciás erősítő áramkör egy lavina-fotodiódát (PD1) és
egy kis bemenőáramú FET-es műveleti erősítőt használ a rendkívül alacsony
fotodióda-áramok IN1+ kimeneti feszültséggé alakítására (kép: Bonnie Baker)

 


Lényeges, hogy ezt az erősítő áramkört a lehető legnagyobb sávszélességgel tervezzük, ezért a parazitakapacitásokat minimálisra kell csökkenteni. Például a C visszacsatolási parazitakapacitás befolyásolja a 2. ábrán látható áramkör stabilitását és sávszélességét. Az erősítő visszacsatolási útvonalában a választott ellenállás méretétől függetlenül mindig lesz valamekkora para­zita­kapacitás. Nagy sebességű eszközökhöz azonban előnyösebb a 0805-ös méret, amelynél nagyobb a távolság a zárósapkák között, és amelynek a legkisebb a parazitakapacitása.
Az R1 ellenállás zárósapkái közötti távolság növelése nem az egyetlen módja a kapacitás csökkentésének. A lemezek közti kapacitás csökkentésének másik módja a parazitakapacitást megnövelő E térerő erővonalainak árnyékolása az R1 ellenállás alatt extra földelő vezetőfelületet kialakítva (3. ábra).

 

Figure 3

3. ábra A visszacsatoló ellenállás alatti földelő vezetőfelület kialakítása elvezeti
az E térerő erővonalait a visszacsatolási oldalról, és a földre vezeti azokat
(kép: Analog Devices)

 


Ebben az esetben a módszer konkrétan egy rövid földelőfelület elhelyezését jelenti a transzimpedanciás erősítő kimeneti végének közelében lévő ellenállásvégek alatt és között. Ez a megoldás 0,028 pF értékű parazitakapacitást eredményez, a transzimpedanciás erősítő sávszélessége pedig az 1/(2π*RF*CPARASITIC) képlettel számítható ki, és ez esetben 11,4 MHz-nek felel meg.
A fényjelek több lavina-fotodióda felé irányulnak, megfelelő optikai szűrőkkel. A lavina-fotodióda, a transzimpedanciás erősítő és az analóg-digitális átalakító alkotta rendszer ezeket a jeleket a digitális megfelelőjükké alakítja át, és az adatokat elküldi további elemzésre a mikroprocesszornak.
A korszerű műszerekben általában több lézer és több lavina-fotodióda van. A jelenleg a kereskedelmi forgalomban kapható eszközökben tíz lézer és harminc lavina-fotodióda található. A lézerek és fotoelektron-sokszorozós érzékelők számának növelése lehetővé teszi a többszörös antitest-megjelölést a célpopulációk fenotípusos markerek alapján történő pontos azonosításához.
Az elemzés sebessége azonban továbbra is a következők finom egyensúlyától függ:

  • a köpenyfolyadék sebessége,
  • a hidrodinamikus fókuszálási eljárás egysejtes sorok kialakítására való képessége,
  • az áramlási alagút átmérője,
  • a sejtek épségének megőrzésére való képesség és
  • az elektronika.

 

Az áramlásos citometria akusztikus fókuszálása

Miközben több lézer és lavina-fotodióda hozzáadásával felgyorsítható az elemzés és az azonosítás, a legújabb korszerű egysejtes áramlásos citometriás módszerek legjobb esetben percenként akár egymillió egyedi sejtről is gyűjthetnek adatokat. Számos felhasználási területen azonban, például a vérben keringő tumorsejtek kimutatására, amelyeknek a szintje nagyon alacsony, akár 100 sejt/milliliter is lehet, ez nem elegendő. A ritka sejtekkel kapcsolatos klinikai felhasználási területeken a vizsgálatok általában több milliárd sejt időigényes elemzését igénylik.
A hidrodinamikus fókuszálással történő sejtelőkészítési eljárás alternatívája az akusztikus fókuszálási eljárás. Itt valamilyen piezoelektromos anyagot, például ólom-cirkonát-titanátot (PZT) rögzítenek egy üvegkapillárishoz, hogy a villamos impulzusokat mechanikus rezgésekké alakítsák (4a. ábra). Azáltal, hogy a PZT segítségével az üvegkapilláris oldalfalait a téglalap alakú áramlási cella rezonanciafrekvenciáján rezegtetik, a rendszer különböző akusztikus állóhullámokat hoz létre, különböző számú nyomáscsomóponttal.

 

Figure 4

4. ábra Egy téglalap alakú üvegkapillárist tartalmazó akusztikus áramlási cella képe (a). Az első három nyomáscsomópont helye állandó szélességű kapilláris esetében (b) (kép: National Center for Biotechnology Information)

 


Ezek a PZT-frekvenciacsomópontok az áramló részecskéket több különálló áramlási vonalba igazítják (4b. ábra). Az akusztikus áramlási cella egy lineáris akusztikus állóhullámot használ arra, hogy egy vagy több felharmonikus létrehozásával különböző hullámhosszokra hangolódjon. Amint az egyszerű lineáris állóhullámmodell alapján várható, a mintában lévő sejtek egy vagy több egysejtes sorba rendeződnek az áramlási kamrában.
A sejtek ilyen pontos sorba rendezésével az áramlási alagút szélessége megnövelhető, hogy a sejtek nagyobb sebességgel áramoljanak el a lézersugár előtt (5. ábra).

 

Figure 5

5. ábra A hidrodinamikusan fókuszált mintaáramlás (c és d) esetében a köpenyszélesség növekedésével a sejtminták szétszóródnak, ami megnehezíti az optikai úton történő mérési folyamatot. Az akusztikusan fókuszált mintaáramlás (a és b) a köpenyszélességtől függetlenül egysejtes sorokat tart fenn (kép: Thermo Fischer Scientific)

 


A hagyományos hidrodinamikus fókuszálás (5c. ábra) a lézeres letapogatás előkészítéseként egysejtes sorokba rendezi a sejteket. Igaz, hogy a szélesebb mintaáramlási alagút a folyadékköpeny nagyobb sebességét teszi lehetővé (5d. ábra), de egyúttal az egysejtes sorok felbomlását és a sejtek szétszóródását is eredményezi, ami a jel ingadozásához és az adatminőség romlásához vezet.
Az akusztikus fókuszálás (5a. ábra) a biológiai sejteket és más részecskéket még szélesebb áramlási alagút esetén is egy sorba igazítva rendezi el. Ez a pontos sejtelrendezés nagyobb mintavételi sebességet tesz lehetővé az adatminőség fenntartása mellett (5b. ábra).
A gyakorlatban az áramlásos citometria akusztikus fókuszálása körülbelül 20-szorosára növeli a sejt-mintavételezési frekvenciát (6. ábra).

 

Figure 6

6. ábra Különböző hidrodinamikus fókuszálású folyadékáramláson alapuló áramlásos citometriás berendezések (A, B, C) és egy akusztikus fókuszálású citometriás berendezés (D) mintavételi idejének összehasonlítása
(kép: Thermo Fischer Scientific)

 


A 6. ábrán látható A, B és C berendezés hidrodinamikus fókuszálási technikát használ, míg a D az akusztikus fókuszálású áramlásos citometriás módszert használja.

 

Akusztikus fókuszálású áramlásos citometriás adatgyűjtés

Az akusztikus fókuszálású áramlásos citometriás berendezések elektronikájának kialakítása nagy sebességű fényérzékelő elektronikát igényel, hogy igazodjon a vérsejtek és a köpenyfolyadék nagyobb átmérőjű fúvókán való áthaladásának sebességéhez. A korábban említett 600 MHz-es, nagy sebességű LTC6268 műveleti erősítő egy 0805-ös méretű ellenállást használó, célirányosan kialakított elrendezéssel 11,4 MHz-re növeli az optikai érzékelés sebességét (7. ábra, balra). Az LTC6268 kimenőjele egy Analog Devices ADAQ23878 analóg-digitális átalakítóba kerül digitalizálás céljából.

 

Figure 7

7. ábra Az ADAQ23878 analóg-digitális átalakító digitalizálja a lavina-fotodióda (PD1) és a transzimpedanciás erősítő áramkör optikai jelét (balra) (kép: Bonnie Baker)

 


Az ADAQ23878 egy 18 bites, másodpercenként 15 millió mintás (MSPS) mintavételi sebességű, nagy pontosságú, nagy sebességű, egy tokba épített rendszerként (SIP) forgalmazott adatgyűjtő megoldás. Nagymértékben csökkenti a nagy pontosságú mérőrendszerek fejlesztési idejét azzal, hogy leveszi a tervező válláról a bemeneti vezérlőeszköz kiválasztásának, optimalizálásának és elrendezésének terhét, és áthárítja azt az eszközre.
Az egy tokba épített rendszerek által használt modulrendszerű megközelítés csökkenti a végrendszer alkatrészeinek számát, mert több közös jelfeldolgozó és jelformáló blokkot egyesít egyetlen eszközben, és tartalmaz egy nagy sebességű, 18 bites, 15 millió minta/másodperc mintavételi sebességű, sorozatos közelítéses regiszterű (SAR) analóg-digitális átalakítót is. Ilyen blokk például az alacsony zajszintű, az analóg-digitális átalakítót vezérlő teljes differenciálerősítő és a stabil referenciapuffer. Az ADAQ23878 tartalmazza a kritikus passzív alkatrészeket is, amelyek az Analog Devices iPassive technikáját használják a hőmérsékletfüggő hibaforrások minimálisra csökkentéséhez és a teljesítmény optimalizálásához. Az analóg-digitális átalakító gyors beállású vezérlőfokozata hozzájárul a gyors adatgyűjtés elősegítéséhez.

 

Az ADAQ23878 µModul kiértékelése

Az ADAQ23878 kiértékeléséhez az Analog Devices az EVAL-ADAQ23878FMCZ fejlesztőkártyát kínálja (8. ábra). A kártya az ADAQ23878 μModul teljesítményét szemlélteti, egy sokoldalú eszköz, amellyel ki lehet értékelni az áramlásos citometria bemeneti oldalának kialakítását, de számos más területen is használható.

 

Figure 8

8. ábra Az EVAL-ADAQ23878FMCZ fejlesztőkártyán megtalálhatók
az ADAQ23878 analóg-digitális átalakító által igényelt tápáram­körök,
el van látva a vezérléshez és adatelemzéshez szükséges szoft­verrel,
és SDP-H1-kompatibilis (kép: Analog Devices)

 


Az EVAL-ADAQ23878FMCZ fejlesztőkártyához egy Windows 10 vagy újabb operációs rendszert futtató személyi számítógép, egy alacsony zajszintű, nagy pontosságú jelforrás és egy 18 bites tesztelésre alkalmas sávszűrő szükséges. A fejlesztőkártyához szükség van az ADAQ23878 ACE beépülő modulra és az SDP-H1 illesztőprogramra is.

 

Összegzés

A biológiai sejtek egyenkénti vizsgálata sikeres ugyan a hagyományos hidrodinamikus fókuszálású áramlásos citometriás technikákkal is, de a gyorsabb elemzés iránti igény miatt a tudomány elmozdult az akusztikus fókuszálású áramlást létrehozó módszereken alapuló technikák irányába. Ugyanakkor az elektronikának is fejlődnie kell, hogy lehetővé tegye a fejlettebb áramlásos citometria megvalósítását, miközben minimálisra kell csökkenteni a helyigényt, a költségeket és a fejlesztési időt is.
Mint látható, az LTC6268 nagy sebességű műveleti erősítő és az ADAQ23878 nagy pontosságú, nagy sebességű μModul adatgyűjtő eszköz kombinációjával létrehozható egy korszerű áramlásos citometriás berendezéshez szükséges teljes adatgyűjtő rendszer.

 

Szerző: Rolf Horn – Alkalmazástechnikai mérnök, Digi-Key Electronics

 

Digi-Key Electronics
www.digikey.hu
Angol nyelvű kapcsolat
Arkadiusz Rataj

Sales Manager Central Eastern Europe & Turkey
Digi-Key Electronics Germany
Tel.: +48 696 307 330
E-mail: arkadiusz.rataj@digikey.com